六味五靈片主要藥效測試

• 日期：2009/10/21
• 來源：世博金都

六味五靈片主要藥效測試方法與結果 
　
•  六味五靈片的保肝降酶實驗
1  對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的影響 [1] ；取 istar 大鼠，按體重隨機分為 6 組，每組 10 只，正常對照組、肝損傷模型組、護肝片組、六味五靈片高、中、低（ 4 、 2 、 1g 生物藥 /kg ）三個劑量組。除正常對照組外。各組動物腹腔注射（ ip ） 30% 四氯化碳（ CCl4 ）植物油 0.2ml/ 100g 體重，每周兩次，共七周，正常對照組 ig 同體積的鹽水。造模同時每日灌胃（ ig ）給藥一次（ 1ml/ 100g ）體重，正常對照組 ig 同體積的蒸餾水，連續給藥 7 周。實驗結束前，動物禁食 12 小時，將動物摘眼球采血，以 3000 轉 / 分離心 10 分鐘，分離血清，測定大鼠血清谷丙轉氨酶（ ALT ）、谷草轉氨酶（ AST ）、總蛋白（ TP ）、白蛋白（ ALB ），采血后將動物處死，取肝組織作羥脯氨酸測定，計算肝膠原蛋白含量 [2] （結果見 1 、 2 ）。同時取一部分肝組織，做組織化學及組織病理學檢查（結果見附件 1 、照片 1 ）。

表 1 六味五靈片對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的影響（ n=10 ）

組別 劑量 肝功能（ X ± SD ）
g/kg
 ALT
（чmol/s）/L  ALT
（чmol/s）/L  TP
（чmol/s）/L  ALB
（g/dL）  白/球
(g/dL） 
對照組  268.00 ± 20.86 634.80 ± 22.51  69.50 ± 4.56 40.60 ± 3.45 1.06 
模型組  797.60 ± 32.29 1458.0 ± 27.75 59.50 ± 5.60 30.60 ± 4.40 1.41 
護肝片  0.4 507.60 ± 25.36 935.20 ± 25.21 67.50 ± 10.20 36.20 ± 2.48 1.16 
六味五靈片 4 464.40 ± 23.90 832.00 ± 34.08 65.89 ± 5.05 37.20 ± 3.26 1.30 
 2  2540.80 ± 32.65 860.86 ± 26.71 65.10 ± 4.87 35.20 ± 2.21 1.17 
 1 528.00 ± 21.92 959.20 ± 28.48 60.80 ± 6.29  34.30 ± 2.01  1.30

與正常組比較 #p<0.05##p<0.01 以下均同：與模型組比較 *p<0.05**p<0.01

表 2. 六味五靈片對大鼠肝膠原蛋白含量的影響（ X ± SD ）

組別 劑量 動物數 膠原蛋白
g/kg
 （只） （ч g/mg 干肝）
對照組  10 22.99 ± 7.21
模型組  10 53.50 ± 11.77
護肝片  0.4 10 40.73 ± 15.43 
六味五靈片 4 10 39.58 ± 16.11
 2  10 36.58 ± 14.07
 1 10 42.50 ± 10.59

與模型組相比， *p<0.05 **p<0.01

表 1 、 2 結果表明六味五靈片可抑制多次注射四氯化碳（ CCI 4 ）引起的大鼠血清轉氨酶的升高、總蛋白（ TP ）和白蛋白（ ALB ）降低，減少肝膠原蛋白含量。

2 ．對 D ——半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響 [3] 取健康小鼠 60 只隨機分為六組，即正常對照組、 D- 半乳糖胺（ D-GaIN ） 650mg/kg 模型組、護肝片組、六味五靈片（ 8 、 4 、 2g /kg ）三個劑量組，每組 10 只。每日灌胃（ ig ）給藥，連續四次，對照組及模型組給與相同容積的蒸餾水，末次藥后一小時，除正常對照組外，小鼠腹腔注射（ ip ）半乳糖胺 0.2ml/ 只，造模后 20 小時，小鼠眶靜脈采血，測血清谷丙轉氨酶（ ALT ）、谷草轉氨酶（ AST ）值（表 3 ），并取肝組織作病理學檢查（結果見附件 2 、照片 2 ）。

表 3. 六味五靈片對 D-GaIN 致小鼠急性肝損傷的影響（ X ± SD ）

組別 劑量 動物數 ALT ALT
g/kg
 （只） （ч mol/s ）/L （ч mol/s ）/L
對照組  10 245.60 ± 7.93  664.40 ± 24.35
模型組  10 668.80 ± 21.01 1262.4 ± 53.61
護肝片  0.8 10 338.00 ± 17.80 803.20 ± 36.36
六味五靈片 8  10 331.60 ± 24.04 820.80 ± 26.67
 4 10 400.80 ± 27.04 829.60 ± 33.38
 2 10 468.4 ± 28.23  949.60 ± 27.62 

與模型組相比， *p<0.05 **p<0.01

表 10. 六味五靈片在鴨體內對鴨乙型肝炎病毒 DHBV-DNA 的影響

組別 劑量 動物數 DHBV-DNA 水平
g/kg
 ( 只 ) L T 均數 T P
對照組  6 0.42 ± 0.11  0.42 ± 0.13  0.44 ± 0.12  0.42 ± 0.11
模型組  6 0.35 ± 0.15 0.26 ± 0.00  0.25 ± 0.07 0.22 ± 0.07
六味五靈片 4.2 6 0.41 ± 0.14  0.30 ± 0.09  0.26 ± 0.10 0.25 ± 0.09
 22  6 0.46 ± 0.09 0.41 ± 0.08 0.38 ± 0.09 0.34 ± 0.11
 11 6 0.44 ± 0.13  0.40 ± 0.13 0.39 ± 0.16 0.37 ± 0.15
無環鳥苷 5.5 6 6 0.51 ± 0.14 0.27 ± 0.12 0.15 ± 0.05 0.33 ± 0.13

給藥組各時相 (T o ,T 5 ,T 10 ,P 3 )DHBV DNAOD 值與病毒對照組各時相 DHBV-DNAOD 值比較， **P<0.01 *P<0.05

結果見表 10 ，六味五靈片可使鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中鴨乙型肝炎病毒 DNA （ DHBVNA ）水平下隆。并且，隨著給藥劑量增加和時間推移，對乙肝病毒抑制作用增強，呈現一定劑量和時間依賴性。停藥后，沒有出現由于病毒再復制而產生的“反跳”現象。

2 ．在 2.2.15 細胞內對乙型肝炎病毒表面抗原、 e 抗原的抑制作用 [11] 藥物六味五靈片用培養基配制成含生藥 16g /L 溶液，以 2 倍稀釋至 8 、 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml 加入 96 孔細胞培養板，每濃度 4 孔，每 4 天換同濃度藥液，設無藥細胞對照組，以觀察細胞病變為指標， 8 天顯微鏡下觀察細胞病變，完全破壞為 4 ； 75% 為 3 ； 50% 為 2 ； 25% 為 1 ；無病變為 0 。計算每濃度藥液平均細胞病變程度和抑制百分率。按 Reed Meuench 法計算 50% 毒性濃度（ TC 50 ），無毒濃度（ TC 0 ），見表 11 。

50—50% 抑制百分率

A=log.50% 抑制百分率 B=log<50% 藥物濃度 C=log 稀釋倍數

表 11 六味五靈片對 2.215 細胞的毒性作用

藥物濃度 細胞病變 破壞百分率 % TC50 ( mg/ml )  TC0 ( mg/ml ) 
16 4 4 4 4  100 9.18 4
8 2 2 1 1 37.5
4 0 0 0 0  0
2 0 0 0 0  0
1 0 0 0 0  0
0.5 0 0 0 0  0

表 11 表明 ，六味五靈片對 2.2.15 細胞產生 50% 毒性濃度（ TC50 ）為 9.18mg/ml ，無毒性濃度（ TC0 ）為 4mg/ml ，提示六味五靈片對 2.2.15 細胞的藥效濃度應選擇 4mg/ml ，并在此濃度以下 2 倍稀試驗藥液。

以每毫升 10 個 2.2.15 細胞接種 24 孔培養板，每孔 lml ， 37 ℃ 5%CO 2 培養 24 小時，加無毒濃度以下 2 倍稀釋度驗藥液， 5 個稀釋度分別為 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml, 每濃度 3 孔， 37 ℃ 5%CO 2 培養，每 4 天換的濃度藥液培養，第 8 天收集培養液， -20 ℃ 冰凍保存。參照固相放射免疫測定盒說明書測定，用γ計數儀測定每孔 cnm 值，實驗設 Hbsag 、 HbeAg 陽性和陰性對照。見表 12 、 13

表 12 六味五靈片在 2.2.15 細胞中第 8 天對表面抗原的影響

藥物濃度 mg/ml Cpm(X ± S) 抑制率 % P/N 5  IC50 ( mg/ml ) 
4 1887 ± 127 31.5  12.94  3.33 
2 2058 ± 245*  24.6  14.41  
1 2211 ± 354  18.3  15.24   
0.5 2363 ± 239 12.1  16.32  
0.25 2528 ± 174  5.4  17.49  
細胞對照  2661 ± 279     
陽性對照
 23951       
陰性對照
 203       
空白對照  62       

與細胞對照相比， **P<0.01 *P<0.05

結果見表 12 、 13 ，六味五靈片在無細胞毒性濃度范圍內，隨著六味五靈片藥液濃度增中，對表面抗原（ HBsAg ）、 e 抗原（ HBeAg ）的抑制程度亦增加，提示六味五靈片對 2.2.15 細胞 HBeAg 、 HBeAg 具有一定抑制作用并呈劑量依賴性。